Om genterapi, att sätta in en gen och råka störa en annan

De flesta ”gener för sjukdomar” är, som vi tidigare konstaterat, genetiska markörer där en variant har ett statistiskt samband med en gen som påverkar risken för en sjukdom på något oftast okänt, sällan helt entydigt, sätt. Men det finns också några få, synnerligen ovanliga, ärftliga genetiska sjukdomar, där en trasig variant av en gen orsakar bekymmer.

Cystisk fibros är en känt exempel — ett trasigt jontransportprotein ger alla möjliga otäcka effekter. Huntingtons sjukdom, där en trasig variant av proteinet huntingtin ansamlas i nervcellerna, är ett annat. När den genetiska grunden för en sådan sjukdom är beskriven är det tyvärr ändå inte alltid klart vad man ska göra med kunskapen. Ibland ger den genetiska grunden en bättre bild av vad det är sjukdomen gör — men ofta är det tvärtom, att sjukdomen är bättre känd än genen, och att det därför är sjukdomsbilden som bidrar med upplysningar om hur genen fungerar. Om det saknade proteinet normalt utsöndras i blodet går det möjligen, som med blödarsjuka eller diabetes, att tillverka det och ge som ersättning.

Men själva genen går det inte att göra något åt, utom med genterapi. Genterapi är precis vad det låter som: att försöka bota genetiska sjukdomar genom att ge patienten nytt genetiskt material — i det enklaste fallet tillföra genen för det protein som är trasigt. Det är en spännande idé som varit på tapeten sedan sjuttiotalet. Det har varit många framsteg sedan dess, men det är ändå svårt; det kommer inte vara ett rutiningrepp inom fem år, om vi säger så.

Det är relativt enkelt att sätta in gener i bakterier eller celler i cellkultur. Bakterierna har nämligen redan ett system med extra DNA-ringar, så kallade plasmider, som de bär på, sprider till sina avkommor vid delning och ibland även delar ut kopior av till andra bakterier. Och celler i cellkultur kan luras att tillfälligt ta upp DNA-molekyler genom att chocka dem med ett elektriskt fält (det kallas med ett målande uttryck elektroporering).

Men det duger inte om vi vill ge en människa nya gener. Människoceller har inget system för att hantera och även om det går att få in naket DNA i kroppen — till exempel genom att skjuta (!) in väldigt små metallkulor med DNA på ytan — så kommer det inte bli kvar särskilt länge. Nej, för att sätta in en gen i en människa och få den att bli kvar där finns det egentligen bara ett sätt: vi behöver hjälp av ett virus.

Några typer av virus reproducerar sig genom att sätta in kopior (som kallas provirus) av sitt genetiska material i värdcellens genom. De mest kända är nog retrovirusen, där det humana immunbristviruset HIV ingår. (Det är ju därför retrovirusen behöver omvänt transkriptas, för att kunna översätta sitt genom till en sekvens som kan sättas in i värdcellens kromosom och sedan uttryckas som om den vore en av värdcellens egna gener.)

Om vi plockar bort alla gener som inte krävs för att kunna infektera, kopiera genomet och sätta in ett provirus får vi istället plats med den gen vi vill tillföra. Det modifierade virusgenomet packas in i en viruspartikel bestående av proteiner som det alltså inte längre har receptet på. Det här sterila viruset kallas en vektor, alltså en bärare av genetiskt material.

Det här exemplet handlar om beta-talassemi, som är ger en form av blodbrist. Problemet här är en brist på betaglobin, en av de proteinkedjor som bygger upp hemoglobin, det protein som transporterar syre i blodet.

Å ena sidan handlar det om en stor framgång, hur en patient med beta-talassemi (som i artikeln kallas för P2) som efter genterapi började producera betaglobin och kunde sluta med blodtransfusioner. Å andra sidan illustrerar det den kanske största svårigheten med genterapi (och varför genreglering inte bara är en angelägenhet för nördar, utan faktiskt är användbar kunskap).

Deras vektor består alltså av betaglobin — samt en några reglerande sekvenser. Det räcker nämligen inte med en kodande DNA-sekvens för att få en fungerande gen; genen måste uttryckas på rätt ställe, i rätt celltyp, också. Före varje gen, innan den kodande delen börjar, finns en region med olika reglerande DNA-sekvenser, som kallas promotor. I promotorn finns olika igenkänningssekvenser för DNA-bindande proteiner, som påverkar hur mycket genen skrivs av.

Kombinationen av vilka reglerande sekvenser som finns i promotorn och vilka transkriptionsfaktorer som uttrycks i cellen bestämmer hur mycket en gen ska uttryckas. (… i stort sett. Det vore inte biologi om det inte funnes fler nivåer än så. Vi kommer till ett exempel strax!) Det fina med betaglobin är att den reglerande sekvensen är relativt specifik, så uttrycket är begränsat till blodceller.

Förutom promotorn som ligger strax före genen kan det finnas andra regioner med liknande funktion som inte ligger i början av genen. De kallas genetiska förstärkare (enhancers på engelska) och kan, trots det namnet, både öka och minska uttrycket. Men problemet är att viruset kan sätta in det nya DNA:t i stort sett var som helst. Om det stör någon viktig gen, som till exempel har med regleringen av celldelning eller celldöd att göra, så löper vi risken att orsaka cancer.

Därför innehåller vektorn också två insulatorelement (insulators på engelska — skyll inte på mig; insulatorelement är Karolinska institutets översättning) i varje ände. De är DNA-sekvenser som hindrar verkan av en genetisk förstärkare. Om insulatorelementet sätts mellan en gen och en förstärkare kommer förstärkaren inte påverka uttrycket av genen.

Gott. Plocka ut benmärgsceller, infektera dem med vektorn, och sätt tillbaks dem. Det är såklart en skitjobbig procedur, men det behövs åtminstone inte en matchande donator. Det är lite som att bli transplanterad med sina egna celler.

Och det verkar fungera. Nya blodceller bildades, så P2 kunde sluta med blodtransfusioner och hans hemoglobinvärden såg okej ut. Författarna har gjort en massa analyser av hans blodceller; vi ska inte gå in vilka, men det mesta är olika varianter av PCR. (Jag säger ju att polymeraskedjereaktionen är en fantastisk teknik!) I majoriteten av de nybildade cellerna har den nya DNA-biten satt sig inuti en annan gen, HMGA2, och i de celler som uttrycker transgenen, har också HMGA2 påverkats. Uttrycket av HMGA2 i de cellerna är ungefär 10 000 gånger större än det normala.

10 000 gånger?! Men det är inte hela HMGA2 som uttrycks. Vi har nämnt det i förbifarten — hos oss eukaryoter (varelser som har cellkärna, till skillnad från bakterier och arkéer) tenderar de kodande bitarna av generna ligga lite utspridda med icke-kodande bitar emellan. De kodande bitarna kallas exoner och de mellanliggande bitarna introner. När genen uttrycks måste intronerna klippas bort för att få fram den slutgiltiga  mallsekvensen (mRNA). Processen kallas splitsning (splicing på engelska). Ibland kan samma gen splitsas på olika sätt och producera olika proteiner. (Men i allmänhet verkar introner mest vara ett mysko slöseri med utrymme.)

HMGA2 har fyra introner och proviruset har satt sig i den tredje. Det finns reglerande sekvenser som styr splitsningen — och proviruset råkar innehålla en sådan. Resultatet blir ett mRNA som innehåller de första exonerna av HMGA2 men avbryts för tidigt. Uttrycket av avbruten HGMA2 eldas på av två saker: dels betaglobinpromotorn och dels en reglerande sekvens i sista exonen, som nu fattas. Där borde nämligen ett kort icke-kodande RNA, ett så kallat mikro-RNA (miRNA), binda till mRNA och få överflödigt mRNA att brytas ner.

Insulatorsekvenserna då? De botar ju inte avsaknaden av miRNA-reglering, men de borde väl avskärma den reglerande sekvensen för betaglobin? En av insulatorerna i ena änden har försvunnit på vägen, och det verkar var tillräckligt för att HMGA2 ska få sig en knäpp. Författarna hade väntat sig att bara en insulator skulle räcka; kanske kan det fungera olika bra beroende på omgivningen?

Alltså, här råkade genterapin ge en biverkning i form av massivt överuttryck av HMGA2. Är det farligt? Kanske inte. HMGA2 har med celltillväxt att göra — där ringer en varningsklocka. Men å andra sidan överuttrycks en liknande kortad variant av HGMA2 ibland i godartade tumörer, inte cancertumörer. Men det är ändå lite oroande — trots utvecklig och sofistikerade nya vektorer brottas genterapin fortfarande med samma typer av problem. Fyrtio år är en kort tid.

Litteratur

Cavazzana-Calvo C et al. (2010) Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia. Nature 467 ss. 318–322 doi:10.1038/nature09328