Polymeraskedjereaktionen (Så går det till, del 1)

Vad är det molekylärbiologer gör — egentligen, alltså rent handgripligen? (Jag brukar säga att det mest går ut på att flytta små mängder vätskor mellan olika rör.) Ifall någon undrar tänkte jag att vi kunde gå igenom några vanliga molekylärbiologiska tekniker. Det kommer alltså inte handla så mycket om ett visst forskningsområde utan mer om några mycket vanliga verktyg.

Molekylärbiologi, förresten? Förledet ”molekylär-” kan sitta på rätt många substantiv, men inom biologi betyder det oftast att DNA och proteiner kommer vara inblandat på något sätt. Min personliga favorit är DNA.

Kort repetition: Deoxyribonukleinsyra (DNA) är den molekyl som lagrar alla cellens proteinrecept (samt några andra recept på användbara RNA-molekyler och en väldig massa onödigt skräp). Koden består av en sekvens av baser, de välkända A, T, G och C.

Polymeraskedjereaktionen (PCR) är en metod för DNA-kopiering i provrör. Den är oerhört användbar i alla möjliga sorters biologi, väldigt vanlig men ibland en smula lynnig. Med PCR går det att välja ut ett kort stycke av en DNA-sekvens. En liten mängd av ett DNA-prov blandas i PCR-reaktionsblandingen, och ifall den eftersökta sekvensen finns där kommer den när reaktionen är klar att finnas i massvis av kopior. Kopiorna kan sedan detekteras på olika sätt.

(Modell av DNA från Wikipedia.)

Alla som sett en DNA-molekyl — och det är förmodligen världens mest avbildade molekyl — vet att den oftast har två strängar som sitter ihop. A, T, G och C binder bara till varandra i vissa kombinationer (A+T och C+G). En dubbelsträngad DNA-molekyl bär alltså på två kopior av samma sekvens, men formulerade på olika sätt. (De sägs inte vara identiska, utan komplementära.)

De två komplementära strängarna är grunden för DNA-kopieringen. I sin första artikel om DNA-molekylens struktur skrev Watson och Crick lite drygt:

It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.

Nå. Det mesta verkar rätt sjävlklart när man vant sig vid det. Men om vi tänker oss att vi kan dela på DNA-molekylen utan att ha sönder den så borde det gå att bygga en ny sträng med de komplementära baserna. Det är så cellerna gör. Och som oftast sker det med hjälp av proteiner.

Enzymerna som gör själva kopieringen kallas DNA-polymeras. En polymer är en stor molekyl som är sammansatt av mindre delar; -as är ett efterled som enzymer brukar bära — enzymet sätter alltså ihop en DNA-kejda av mindre byggstenar som kallas nukleotider.

I labbet använder vi oftast DNA-polymeras från Thermus aquaticus. Det är en bakterie som lever i varma källor och är alltså van vid värme. Upptäckarna Brock & Freeze isolerade den från varma källor i Yellowstone; hur coolt är inte det! Taq-polymeraser, som olika varianter av dess DNA-polymeras kallas, är värmetåliga till skillnad från de flesta proteiner förlorar sin struktur när de blir varma — exempel: äggvita.

Varför behöver det vara varmt, då? Cellen använder ett komplicerat system av olika proteiner för att packa ihop och packa upp sitt DNA. Topoisomeraser rullar upp DNA-molekylen så att polymeraserna kommer åt. Olika stödjeproteiner skyddar den ensamma strängen tills den blivit kopierad. I provröret, däremot, har vi DNA i vattenlösning och då är det mycket enklare — framför allt för att vi har betydligt högre koncentration DNA; om en och annan sträng går sönder finns det tusen åter. För att separera DNA-strängarna värmer vi helt enkelt till typ 95 grader Celsius. För att få dem att para ihop sig igen kan vi bara låta blandningen svalna — lämpligen till en temperatur där Taq-polymeraset är högaktivt, typ 72 grader Celsius.

Det är en bit som fattas: DNA-polymeraset kan inte börja bygga nya DNA-strängar var som helst; det bygger bara vidare på en sträng som redan är påbörjad. Därför tillsätter vi korta DNA-strängar, som kallas primers, som ringar in det område vi vill kopiera. För att primrarna ska kunna binda till DNA-strängen som ska kopieras sänker vi temperaturen en stund innan vi går upp till 72 grader.

Och så upprepar vi, som i PCR-programmet ovan. Vid varje cykel separeras och kopieras DNA-strängarna. Här finns en liten Youtube-video som illustrerar det (men stäng av musiken!):

PCR dyker upp överallt. När vi vill typa någon genetisk markör, sekvensbestämma en gen, klona en gen eller nästan vad som helst annat brukar PCR komma in på något hörn. Men den enklaste DNA-analysen efter PCR är förmodligen elektrofores i en agarosgel. Det får bli del två — men här är en bild på en gel så länge:

(Gelbild från Jackie K alias _intellinuts_. Publicerad på Flickr och Creative commons-licensierad.)

Litteratur

Watson JD, Crick FHC. (1953) A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 4356 ss. 737-738

Brock TD, Freeze H. (1969) Thermus aquaticus gen. n. and sp. n. A Nonsporulating Extreme Thermophile. Journal of Bacteriology ss. 289-297

6 thoughts on “Polymeraskedjereaktionen (Så går det till, del 1)

  1. Pingback: Agarosgelelektrofores (Så går det till, del 2) « There is grandeur in this view of life

  2. Pingback: Omvänd transkription och komplementärt DNA (Så går det till, del 3) « There is grandeur in this view of life

  3. Pingback: Om genterapi, att sätta in en gen och råka störa en annan « There is grandeur in this view of life

  4. Pingback: Undervisning: polymeraskedjereaktionen | There is grandeur in this view of life

  5. Pingback: Efter NBIA25: Vad jag vill lära ut | There is grandeur in this view of life

  6. Pingback: Inför NBIC45: hurra för pcr! | There is grandeur in this view of life

Kommentera

Fyll i dina uppgifter nedan eller klicka på en ikon för att logga in:

WordPress.com Logo

Du kommenterar med ditt WordPress.com-konto. Logga ut / Ändra )

Twitter-bild

Du kommenterar med ditt Twitter-konto. Logga ut / Ändra )

Facebook-foto

Du kommenterar med ditt Facebook-konto. Logga ut / Ändra )

Google+ photo

Du kommenterar med ditt Google+-konto. Logga ut / Ändra )

Ansluter till %s