Omvänd transkription och komplementärt DNA (Så går det till, del 3)

Så, med PCR och agarosgel har vi det viktigaste verktyget för att analysera DNA. Men DNA i sig gör ju ingen glad, eller får åtminstone inte särskilt mycket att hända. Först måste generna uttryckas.

(Bild av transkription av Wikipedia-användaren Forluvoft; översatt och något förändrad av mig.)

Det första steget kallas transkription; genen skrivs av till en arbetskopia i form av RNA. Bilden ovan visar huvuddragen av hur det går till: DNA skrivs av med ett RNA-polymeras (den bruna ovalen); de lila och blå ovalerna symboliserar ett komplex av transkriptionsfaktorer, proteiner som binder till början av en gen och får den att uttryckas.

Arbetskopian (den blå strängen i bilden) kallas mRNA, messenger RNA (på svenska kanske budbärar-RNA eller mall-RNA) RNA är en nukleinsyra som är mycket lik DNA — den har en annan sockerart i sin ryggrad (ribos istället för deoxyribos) och använder basen uracil istället för tymin; den parar med adenin precis som tymin, så RNA använder väsentligen samma alfabet. RNA är oftast enkelsträngat, om allt går till som det ska.

RNA:t kommer sedan transporteras ut från kärnan, behandlas på olika sätt, och efter hand brytas ner igen av enzymer som finns i cellen. Men innan dess har det förhoppningsvis hunnit göra sitt jobb. RNA som kodar för gener förs till ribosomen, cellens proteinfabrik, och utgöra mall för proteinsyntes. Andra RNA-molekyler, bland annat de som bygger upp själva ribosomen och en mängd korta genreglerande RNA-bitar (som kallas mikro-RNA) verkar utan att något protein tillverkas.

(Relativt nya resultat tyder på att cellen dessutom tillverkar en massa RNA från olika ställen i genomet som ingen har en aning om vad de skulle kunna vara bra för. Men de lärde, med flera, tvistar om ifall de mätningarna verkligen stämmer. Det borde vi nog återkomma till.)

Vi har alltså goda anledningar att intressera oss för RNA. (RNA är bäst!) När vi vill veta vad som skiljer olika celltyper eller hur celler reagerar på miljöförändringar är det ofta lättare att titta på mRNA än på de proteiner generna ska producera. När vi vill veta hur gener regleras kan vi behöva mäta flera olika sorters RNA. Kan vi använda PCR till det här? Klart vi kan! Men för att kopieringen ska fungera behöver vi DNA, inte RNA. Vi behöver alltså en göra DNA-kopia med vårt RNA som mall; det är som transkription fast tvärt om och kallas alltså omvänd transkription.

I naturen finns det organismer (om de nu kan kallas så) som utför den process en som en del av sin livscykel (om den nu kan kallas så), nämligen retrovirus. HIV och andra virus av den typen har sina genom lagrade i form av RNA. De saknar eget proteinsyntesmaskineri och behöver därför utnyttja värdcellens proteiner och ribosomer för att uttrycka sina gener och bygga proteiner. För att åstadkomma det sätter de in sitt genom i värdcellens kromosomer; de starka reglerande sekvenser virusgenerna bär med sig lurar cellen att börja uttrycka virusgener i massor. De har alltså samma problem som vi — de har RNA och behöver DNA. Därför bär de med sig ett enzym som kallas omvänt transkriptas.

Det är ett enzym med flera funktioner och själva reaktionen är ganska omständig. Liksom ett vanligt DNA-polymeras utgår det från en primer (en kort bit nukleinsyra att börja bygga från) och bygger sedan en ny sträng med den gamla som mall. Den gamla strängen är RNA, men den nya är DNA. DNA:t är komplementär mot RNA-biten — den har alltså samma kod men är uttryckt i motsvarande komplementära baser (C blir G, A blir U och vice versa). Påhittiga biologer har tagit omvänt transkriptas från olika retrovirus, satt in i bakterieceller och renframställer omvänt transkriptas som finns att köpa för dem som behöver.

Viruset använder en primer av tRNA som finns naturligt i cellen och passar in på en bit av virusgenomet. När vi gör reaktionen i provrör, däremot, tillsätter vi olika primers beroende på vilket RNA vi vill kopiera. Är det bara en viss gen kan vi använda en primer bara för den; om det är RNA i allmänhet vi är ute efter kan vi antingen ta en kort slumpvis sekvens som kommer binda till RNA lite var som heslt, eller en primer bestående av en lång sekvens av T (oligo-dT, som det brukar kallas). mRNA som ska bli proteiner får nämligen en lång svans av A:n. (Det här är en liten konstighet cellen håller på med; svansen är användbar för att RNA-molekylen ska transporteras rätt och inte brytas ner så fort.)

Resultatet blir alltså enkelsträngat cDNA: DNA-strängar som är komplementära till RNA. Vilket RNA beror på typen av primer — genspecifika primers ger RNA från en viss gen, oligo-dT-primers ger mRNA i allmänhet, slumpvisa primers ger vilket RNA som helst.

Enkelsträngat DNA är också DNA och duger utmärkt till PCR. Kombinationen av omvänd transkription (RT) och polymeraskedjereation (PCR) kallas RT-PCR. Lagom fantasifull benämning. PCR-produkten kan vi analysera på en gel som vilket DNA som helst, eller använda till något annat.

Vill vi däremot ha dubbelsträngat cDNA, vilket är stabilare och krävs för vissa andra tillämpningar, får vi anstränga oss lite mer. För den som tyckte PCR var ett påhittigt missbruk av naturligt förekommande enzymer, lyssna på det här: Först tillsätter vi RNas H, ett enzym som bryter ner RNA (egentligen har omvänt transkriptas redan den aktiviteten också, men den brukar tas bort från de rekombinanta enzymerna för att hålla RNA-mallen intakt så länge som möjligt); ett DNA-polymeras I (från tarmbakterien och laboratorietrotjänaren Escherichia coli) som bygger upp den andra DNA-strängen med utgångspunkt från de kvarvarande RNA-resterna; och mot slutet ett DNA-polymeras från bakterieviruset bakteriofag T4 som fyller i luckorna som blir kvar i den andra DNA-strängen efter att E. coli-polymeraset är färdigt. Sedan renar vi fram dubbelsträngat cDNA från reaktionsblandningen — kanske med en kolonn eller med en blandning av fenol och kloroform.

Om det ska anses som väldigt fiffigt eller extremt omständigt beror förmodligen på personlig smak och läggning. cDNA får vi i alla fall.