Undervisning: Molekylärgenetik

NBIC45 utgår! Leve NBIC52! Den senaste varianten av molekylärgenetikkursen har just börjat. Nu var det inte tänkt att jag skulle undervisa något i år, men jag hoppar in som ställföreträdande skägg. Så läraruppställningen ändras lite mindre än det var tänkt från början.

Provrörsställ, rör, lösningar, pipetter och blåsippor som inte har med saken att göra.

Laborationerna, där en kan träffa mig, handlar om nöjsamma saker som genotypning med polymeraskedjereaktionen och att transformera bakterier med plasmider. Och att tolka inte alltid helt tydliga band på geler, samt stå i kö till centrifugen. Jag tycker det är rätt roligt. Att stå i kö till centrifugen är kanske inte det roligaste i världen. Men alla som arbetat i ett molekylärt laboratorium kan intyga att det i alla fall är realistiskt.

Jag har skrivit (och twittrat) något om innehållet i labbarna förut.

Annonser

Inför NBIC45: hurra för pcr!

Våren är alltså min undervisningssäsong. Nu är det dags för NBIC45, Molekylärgenetik, där jag är med och håller i ett par laborationer. Det här är den av kurserna som är närmast det jag själv håller på med och dessutom roligast. Nåja, de som inte tänker syssla med genetik kanske inte tycker att det är fullt lika underhållande, men det kan ändå vara bra att veta lite om hur molekylärgenetik går till. Bland annat ska vi ta fram dna, kopiera det med polymeraskedjereaktionen och titta på produkterna på agarosgel.

Om någon av studenterna skulle leta sig hit: Här är några poster från tidigare år:

Polymeraskedjereaktionen
Att tolka agarosgel
Så går det till: att ta fram DNA och RNA, polymeraskedjereaktionen och agarosgelelektrofores.

Och här är lite inofficiell rekommenderad läsning: Dels patentet på pcr (Kary Mullis m.fl) från 1987 och ”Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors”, Yanisch-Peron, Veira & Messing (1985), som beskriver plasmiden pUC19 som vi använder i andra laborationen.

Om den andra kursen som börjar nu, Communicating science, har jag inte lika mycket att säga, mer än att Martins regler för vetenskapskommunikation lyder:

1. Om det överhuvudtaget är möjligt, nämn dinosaurier.

2. Påstå inte att din forskning hjälper till att bota cancer om inte din forskning faktiskt handlar om att bota cancer.

Att tolka agarosgel

Några ord och bilder om att tolka och tyda resultaten av agarosgelelektrofores:

tolka_gel

I bilden står det:

Martins guide till att tolka agarosgel

Vanlig gel efter pcr (för sekvensering eller dylikt): produkt av förväntad längd; ett band från specifik pcr. Inget band i negativ kontroll. Korta svaga primer dimer-band kan vara acceptabelt. Stege.

Storleksbestämning (t.ex. gentypning med mikrosatelliter): Olika alleler ger olika lång produkt (ofta en liten skillnad). Två band — heterozygot. Det behövs en negativ kontroll här också, men jag ritade en för liten gel.

Den ökända fruktade tomma gelen: Kolla dina anteckningar och beräkningar! Gör om pcr-reaktionen minst en gång innan du blir förtvivlad! Avsaknad av band betyder inte att sekvensen saknas. För att visa avsaknad av den sökta sekvensen krävs smarta positiva kontroller.

Lycka till i labbet!

Agarosgelelektrofores (Så går det till, del 2)

Till utseendet är den ena DNA-lösningen den andra lik; det ser ut som lite vatten i ett rör (vilket det såklart till största delen också är). Så, om vi just kopierat upp till exempel en bit av en gen, hur får vi veta om det är något där? Som sagt finns det många mer eller mindre sofistikerade sätt att analysera DNA, men det kanske enklaste och vanligaste är elektrofores i en agarosgel.

Elektrofores betyder att laddade partiklar rör sig i ett elektriskt fält; eftersom olika laddningar attraherar varandra kommer negativt laddade saker att vandra mot pluspolen och positivt laddade saker vandra mot minuspolen. Agaros finns i agar-agar och används i matlagning för att göra olika geléartade rätter. Agaros är (liksom DNA) en polymer, alltså en mycket lång molekyl. I en agarosgel ligger agarosmolekylerna lite kors och tvärs och får stora molekyler att röra sig långsammar än de skulle göra i en vätska. För att analysera DNA gjuter vi ett block av agarosgel, dränker den i en balja med saltlösning (för att leda strömmen ordentligt), stoppar ner DNA och sedan lägger vi på elektrisk spänning.

DNA är negativt laddat och vandrar alltså mot den positiva änden av baljan (så här kan ett litet elektroforeskar se ut). Långa DNA-bitar kommer hindras mer av agarosen och vandra långsammare. Låt oss nu titta på Jackie K:s gelbild (Creative Commons-licensierad) igen:

Randen av svarta rutor allra överst i bilden är brunnar i gelen där DNA-proverna hälls ner. Varje brunn innehåller ett prov som sedan vandrat rakt ner längs med bilden. De ljusa banden är DNA. För att de ska synas innehåller gelen ett DNA-bindande fluorescent färgämne.

Banden som vandrat längst i gelen, längre ner i bilden, är kortast. För att ha något att jämföra med använder vi en så kallad stege, en blandning av DNA-bitar med kända längder. Det är en sådan vi ser i första brunnen till vänster. Efter stegen kommer proverna. Den kortaste DNA-biten är i den fjärde brunnen; den längsta i den första.

Gelen är klar och fin med bara ett band från varje brunn (utom stegen, såklart). Om det är PCR-produkter på gelen betyder det att det är en bra och specifika PCR-reaktioner, som bara kopierar upp en sekvens. (Eller möjligen i värsta fall två olika sekvenser med precis lika långa produkter.) Mer än så kan vi nog inte tolka den här bilden utan att veta vad det är för prover.

Agarosgel duger bra för prover med mycket DNA (PCR-produkter, exempelvis) och för att skilja DNA-bitar som skiljer sig kanske 50-100 baser i storlek. För att separera mindre fragment eller proteiner, som inte är lika långa och skrymmande som DNA och alltså inte hindras nämnvärt av agarosgel, går det att använda gel av polyakrylamid. (Hallandsåsen, någon?) För små mängder DNA finns det elektroforesmaskiner med kapillärer, väldigt tunna rör fulla med gel, som inte kräver så stora mängder prov.

Polymeraskedjereaktionen (Så går det till, del 1)

Vad är det molekylärbiologer gör — egentligen, alltså rent handgripligen? (Jag brukar säga att det mest går ut på att flytta små mängder vätskor mellan olika rör.) Ifall någon undrar tänkte jag att vi kunde gå igenom några vanliga molekylärbiologiska tekniker. Det kommer alltså inte handla så mycket om ett visst forskningsområde utan mer om några mycket vanliga verktyg.

Molekylärbiologi, förresten? Förledet ”molekylär-” kan sitta på rätt många substantiv, men inom biologi betyder det oftast att DNA och proteiner kommer vara inblandat på något sätt. Min personliga favorit är DNA.

Kort repetition: Deoxyribonukleinsyra (DNA) är den molekyl som lagrar alla cellens proteinrecept (samt några andra recept på användbara RNA-molekyler och en väldig massa onödigt skräp). Koden består av en sekvens av baser, de välkända A, T, G och C.

Polymeraskedjereaktionen (PCR) är en metod för DNA-kopiering i provrör. Den är oerhört användbar i alla möjliga sorters biologi, väldigt vanlig men ibland en smula lynnig. Med PCR går det att välja ut ett kort stycke av en DNA-sekvens. En liten mängd av ett DNA-prov blandas i PCR-reaktionsblandingen, och ifall den eftersökta sekvensen finns där kommer den när reaktionen är klar att finnas i massvis av kopior. Kopiorna kan sedan detekteras på olika sätt.

(Modell av DNA från Wikipedia.)

Alla som sett en DNA-molekyl — och det är förmodligen världens mest avbildade molekyl — vet att den oftast har två strängar som sitter ihop. A, T, G och C binder bara till varandra i vissa kombinationer (A+T och C+G). En dubbelsträngad DNA-molekyl bär alltså på två kopior av samma sekvens, men formulerade på olika sätt. (De sägs inte vara identiska, utan komplementära.)

De två komplementära strängarna är grunden för DNA-kopieringen. I sin första artikel om DNA-molekylens struktur skrev Watson och Crick lite drygt:

It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.

Nå. Det mesta verkar rätt sjävlklart när man vant sig vid det. Men om vi tänker oss att vi kan dela på DNA-molekylen utan att ha sönder den så borde det gå att bygga en ny sträng med de komplementära baserna. Det är så cellerna gör. Och som oftast sker det med hjälp av proteiner.

Enzymerna som gör själva kopieringen kallas DNA-polymeras. En polymer är en stor molekyl som är sammansatt av mindre delar; -as är ett efterled som enzymer brukar bära — enzymet sätter alltså ihop en DNA-kejda av mindre byggstenar som kallas nukleotider.

I labbet använder vi oftast DNA-polymeras från Thermus aquaticus. Det är en bakterie som lever i varma källor och är alltså van vid värme. Upptäckarna Brock & Freeze isolerade den från varma källor i Yellowstone; hur coolt är inte det! Taq-polymeraser, som olika varianter av dess DNA-polymeras kallas, är värmetåliga till skillnad från de flesta proteiner förlorar sin struktur när de blir varma — exempel: äggvita.

Varför behöver det vara varmt, då? Cellen använder ett komplicerat system av olika proteiner för att packa ihop och packa upp sitt DNA. Topoisomeraser rullar upp DNA-molekylen så att polymeraserna kommer åt. Olika stödjeproteiner skyddar den ensamma strängen tills den blivit kopierad. I provröret, däremot, har vi DNA i vattenlösning och då är det mycket enklare — framför allt för att vi har betydligt högre koncentration DNA; om en och annan sträng går sönder finns det tusen åter. För att separera DNA-strängarna värmer vi helt enkelt till typ 95 grader Celsius. För att få dem att para ihop sig igen kan vi bara låta blandningen svalna — lämpligen till en temperatur där Taq-polymeraset är högaktivt, typ 72 grader Celsius.

Det är en bit som fattas: DNA-polymeraset kan inte börja bygga nya DNA-strängar var som helst; det bygger bara vidare på en sträng som redan är påbörjad. Därför tillsätter vi korta DNA-strängar, som kallas primers, som ringar in det område vi vill kopiera. För att primrarna ska kunna binda till DNA-strängen som ska kopieras sänker vi temperaturen en stund innan vi går upp till 72 grader.

Och så upprepar vi, som i PCR-programmet ovan. Vid varje cykel separeras och kopieras DNA-strängarna. Här finns en liten Youtube-video som illustrerar det (men stäng av musiken!):

PCR dyker upp överallt. När vi vill typa någon genetisk markör, sekvensbestämma en gen, klona en gen eller nästan vad som helst annat brukar PCR komma in på något hörn. Men den enklaste DNA-analysen efter PCR är förmodligen elektrofores i en agarosgel. Det får bli del två — men här är en bild på en gel så länge:

(Gelbild från Jackie K alias _intellinuts_. Publicerad på Flickr och Creative commons-licensierad.)

Litteratur

Watson JD, Crick FHC. (1953) A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 4356 ss. 737-738

Brock TD, Freeze H. (1969) Thermus aquaticus gen. n. and sp. n. A Nonsporulating Extreme Thermophile. Journal of Bacteriology ss. 289-297