Morning coffee: epigenetic inheritance of odour sensitivity

kaffe_tryffel

A while ago I wrote a bit about the recent paper on epigenetic inheritance of acetophenone sensitivity and odorant receptor expression. I spent most of the post talking about potential problems, but actually I’m not that negative. There is quite a literature building up about these transgenerational effects, that is quite inspiring if a little overhyped. I for one do not think epigenetic inheritance is particularly outrageous or disrupting to genetics and evolution as we know it. Take this paper: even if it means inheritance of an acquired trait, it is probably not very stable over the generations, and it is nothing like a general Lamarckian transmission mechanism that can work for any trait. It is probably very specific for odourant receptors. It might allow for genetic assimilation of fear of odours though, which would be cool, but probably not at all easy to demonstrate. But no-one knows how it works, if it does — there are even multiple unknown steps. How does fear conditioning translate to DNA methylation differences sperm that translates to olfactory receptor expression in the brain of the offspring?

A while after the transgenerational effects paper I saw this one in PNAS: Rare event of histone demethylation can initiate singular gene expression of olfactory receptors (Tan, Song & Xie 2013). I had no idea olfactory receptor expression was that fascinating! (As is often the case when you scratch the surface of another problem in biology, there turns out to be interesting stuff there …) Mice have lots and lots of odorant receptor genes, but each olfactory neuron only expresses one of them. Apparently the expression is regulated by histone 3 lycine 9 methylation. The genes start out methylated and suppressed, but once one of them is expressed it will keep all other down by downregulating a histone demethylase. This is a modeling paper that shows that if random demethylation happens slowly enough and the feedback to shut down further demethylation is fast enough, these steps are sufficient to explain the specificity of expression. There are some connections between histone methylation and DNA methylation: it seems that DNA methylation binds proteins that bring histone methylases to the gene (review Cedar & Bergman 2009). Dias & Ressler saw hypomethylation near the olfactory receptor gene in question, Olfr151. Maybe that difference, if it survives through to the developing brain of the offspring, can make demethylation of the locus more likely and give Olfr151 a head start in the race to become the first expressed receptor gene.

Literature

Brian G Dias & Kerry J Ressler (2013) Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations Nature neuroscience doi:10.1038/nn.3594

Longzhi Tan, Chenghang Zong, X. Sunney Xie (2013) Rare event of histone demethylation can initiate singular gene expression of olfactory receptors. PNAS 10.1073/pnas.1321511111

Howard Cedar, Yehudit Bergman (2009) Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms. Nature reviews genetics doi:10.1038/nrg2540

Annonser

Journal club of one: ”Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations”

Okay, neither chickens nor genetics, really, but a little epigenetic inheritance. Dias & Ressler in Nature neuroscience:

When an odor (acetophenone) that activates a known odorant receptor (Olfr151) was used to condition F0 mice, the behavioral sensitivity of the F1 and F2 generations to acetophenone was complemented by an enhanced neuroanatomical representation of the Olfr151 pathway.

Meaning that the offspring of conditioned mice score higher in an odour potentiated startle test (more about that below), avoid the odour at a lower concentration in an aversion test and have more neurons expressing that odorant receptor in their olfactory epithelium and bulb, counted by betagalactosidase staining in transgenic mice expressing M71, the product of Olfr151, coupled to LacZ.

Furthermore,

Bisulfite sequencing of sperm DNA from conditioned F0 males and F1 naive offspring revealed CpG   hypomethylation in the Olfr151 gene. In addition, in vitro fertilization, F2 inheritance and cross-fostering revealed that these transgenerational effects are inherited via parental gametes.

That is, they detect a difference in methylation in one CpG dinucleotide in the 3′ region of the gene.

Comments:

First, I love how the journal does exactly the thing I like to see with figures: below each figure is a link that leads to a data file with the underlying data!

Olfactory behaviour is not my thing, so the tests are new to me, but I’m a bit puzzled by the way they calculate the results from the odour potentiated startle tests. The point is to test whether the presence of the odour make the mice react stronger to a noise. After buzzing the sound 15 times without odour, they perform ten trials with odour plus sound and ten trials with sound only. But in calculating the score, they use only the difference between the first trial with odour and the last trial with sound only divided by how much the mouse reacted to the last of the first 15 sounds. Maybe this is standard, but why throw away the trials in between?

It is not only the olfactory potentiated startle and the sensitivity test, but the staining results. Again, this is not my area, but the results all seem to point to increased sensitivity in the offspring of the treated animals. They react stronger in the startle test, react at lower concentration in the avoidance test and they (in this case, the transgenic mice) have more neurons expressing M71. The cross fostering and the fact that the males were treated but not the females points to genuine inheritance. So, how does the treatment get into the germline? It has to cross that boundary and enter the sperm somehow. Unless there is some mysterious way for information from the central nervous system to travel to the testis, acetophenone must affect the spermatogenesis as well as the olfactory neurons.

All this is very hypothetical, so a little skepticism is not surprising. Gonzalo Otazu wrote in a comment on the Nature news webpage:

The statistical tests in the paper, both for the behavioral measurements as well as for the size of the M71 glomeruli , use as n, number of samples, the number of F1 and F2 individuals. This would be fine if the individuals were actually independent samples. However, they arise from a presumably small number of FO males. The numbers of FO males are not given in the paper. This is a major concern given that there is a lot of variability in the levels of expression of olfactory receptors in these mice that might be inheritable …

I think this is a good point but it will not be solved, as the comment later suggests, by adjusting the degrees of freedom of the test. From the F1 generation and on, genetic differences between the treatment groups, if they do exist, will amplify into a bias issue. That is, it is a systematic difference that might be bigger or smaller than the treatment effect and go in the same or opposite direction — we don’t know. However, the bias should not be there all the time, and not in the same direction, so it strengthens the authors’ case that they’ve done the treatment at least twice (with C57B/6J and with M17-LacZ mice, if not more times).

Maybe my preference for genetics is showing, but I feel the big unadressed alternative hypothesis in most transgenerational effects experiments is cryptic heritability. If you divide individuals into two groups, treat one of them and look for treatment effects in the offspring, you need to be sure that there are not genetc differences between the founders of the two groups. In the subsequent generations, genetic and non-genetic inheritance will be counfounded by design.

Again, randomisation and replication will help, but to be really sure, maybe one can use founders of known relatedness to create a mixed population — say take founders from full-sibships and split them equally between treatment groups, allowing segregation to randomise the genotypes of the next generation. It doesn’t say in the methods — the authors might even have done something like this. One could even use a genetic mixed model that includes relatedness as to estimate treatment effects over in the prescence of a genetic effect. I have a suspicion this experiment would require a much larger sample size, which means more time, work and animals — but I also believe that many would find confounding genetic variation more plausible than transgenerational epigenetic effects of unknown mechanism.

Literature

Brian G Dias & Kerry J Ressler (2013) Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations Nature neuroscience doi:10.1038/nn.3594

Epigenetik: gul päls och en svansknyck, de bästa exemplen på epigenetiskt arv

Om epigenetik bara vore några mekanismer för genreglering skulle det knappast vara ett sådant liv om epigenetiken. SVT:s vetenskapsmagasin skulle inte låta ett par nyblivna föräldrar visa upp sin dotter medan en allvarlig berättarröst pratade om epigenetikens hypotetiska påverkan på barnets lysande framtid. Det är något mer på gång.

Epigenetik är allt som går i arv från cell till dottercell och som inte kan förklaras av DNA-sekvens eller gemensam yttre miljö — och påverkar vilka gener cellen ska uttrycka. Epigenetiska skillnader kan inte (vad vi vet) ändra på proteiners uppbyggnad — de ändrar alltså inte genernas sekvens — men annars kan de potentiellt förändra det mesta i hur cellen fungerar. En förändring i en enda gens uttrycksnivå kan, som vi strax ska se, ha rätt konstiga effekter.

Det finns en rad exempel på ärftlighet som inte låter sig förklaras av DNA-sekvenser eller gemensam yttre miljö, och vi borde återkomma till några av dem. Men det är väldigt få där vi har någon aning om hur det går till och kan knyta det till någon av de epigenetiska mekanismer som beskrivits på molekylär nivå — DNA-metylering till exempel.

Såvitt jag vet finns det två riktigt bra exempel på epigenetiskt arv där någon verkligen lyckats ta reda på vad som försiggår. Båda handlar, kanske föga förvånande, om små gnagare: gula möss och andra möss med en knyck på svansen. Båda handlar dessutom om DNA-metylering och om en särskild kul form av mutation. (Vi har stött på den tidigare, i Craig Venters med flera Mycoplasma-bakterie med syntetiskt tillverkat genom.)

Mössens genom, liksom de flesta andra djur och växters, är nämligen fullt med transposoner: upprepade sekvenser som kodar för gener som kan klippa och klistra i genomet — och sätta in kopior av sig själva! Det är ganska absurt. Hur vi fått alla de här eländiga självkopierande generna kan diskuteras, men en del av dem stammar helt klart från retrovirus. Det hör till retrovirusens livscykel att sätta in en kopia (ett så kallat provirus) av sitt hela sitt genom i värdcellens kromosomer. Om proviruset råkar hamna i könscellerna kan de gå i arv till nästa generation och bli en del av värdorganismens genom. Det är en sjukt osannolik händelse, men uppenbarligen händer det då och då. Det verkar inte finnas något vettigt sätt för värdorganismen att bli av med de här virusresterna. Istället använder den DNA-metylering som ett sätt att hindra dem från att uttryckas.

Så, mössen i fråga har drabbats av bitar av retrovirus sin agouti– respektive axin-gen. I de första mössens fall gör mutationen att de får ovanlig färg. Agouti är namnet på den vanliga bruna färgen, och också namnet på en gen som har med pigmentering att göra. Möss som har genvarianten agouti viable yellow har olika färg, från gula (eller kanske mer gulbruna) till normalbruna. Och — mycket riktigt — färgen går i arv från mor till ungar.

Hur kan vi då vet att det inte är vanligt hederligt genetiskt arv? Morgan & co (1999) studerade inavlade agouti viable yellow-möss som är genetiskt identiska. (Inavlade möss av olika slag finns att beställa på postorder; det är förmodligen både en följd av och anledning till att så många jobbar med möss.)

Nästa mus har en variant av genen axin som kallas axin fused (Rakyan m.fl. 2003). Möss med just den varianten kan ha knyckar på sin svans. Precis som färgen på agouti viable yellow-mössen går antalet böjningar av i arv. Men inte bara från mor till unge, utan också på fädernet. Inte nog med det, DNA-metyleringen finns både i vanliga celler i kroppen (somatiska celler, säger biologer ibland) och i spermier (som ju är könsceller), och skulle alltså kunna gå direkt i arv den vägen.

Särskilt hos däggdjuren har fostret betydligt fler kontaktytor med modern än med fadern, så det finns många möjliga vägar för icke-genetiskt arv. Men när det gäller hanen finns det inte mer än det som ryms i spermien, som bär på kromosomerna men förhållandevis lite proteiner och RNA. Det lustiga är att agouti viable yellow också har samma mönster i spermier som somatiska celler, fast den inte går i arv på fädernet.

(axin fused-möss från Whitelaw-laboratoriet, varifrån båda artiklarna jag refererar kommer; bilden kommer från den här artikeln och är Creative commons-licensierad.)

Sammanfattningsvis är det inte helt olikt fallet med patient P2: han fick genterapi mot betatalassemi men genterapivektorn som var baserad på ett virus, råkade sätta in en genetisk förstärkare mitt i HMGA2-genen. Därmed knöts HMGA2-uttryck till den en ny reglerande sekvens. I viable yellow-mössens fall råkade transposonen sätta in sig i en gen som reglerar pigmentering. Agoutigenens uttryck kopplas alltså till uttrycket av transposonen. Och i och med att transposonen regleras av DNA-metylering regleras aguoti också av DNA-metylering.

Förresten, varför är det en stor grej att metyleringen av axin fused går igen i spermier? När könscellerna bildas nollställs normalt DNA-metyleringen. Epigenetiska markörer har ju med celldifferentiering att göra, och könscellerna ska bilda det nya embryot — ett enda befruktat ägg ska ge upphov till alla celltyper i den nya kroppen. Men all DNA-metylering försvinner inte. Vi har redan tagit upp genetisk prägling — vissa gener metyleras och uttrycks olika beroende på om de går i arv från mamma eller pappa. Och det verkar också finnas vissa lysande undantag, sekvenser som inte får sina metyleringar raderade, bland annat agouti viable yellow och axin fused.

Det är sådana sekvenser — vilka de nu är och hur många nu kan vara — som öppnar för ärftliga DNA-metyleringar. Om de dessutom på något sätt är känsliga för miljöpåverkan öppnar de för ärftliga förvärvade egenskaper. Det är åtminstone teoretiskt möjligt att de kan ligga bakom andra epigenetiska ärftliga saker. Vad är det då som utmärker de här sekvenserna? Ingen vet. Hur som helst, djurs och växters genom är fulla av retrotransposoner och det är mycket möjligt att en del av dem får gener att fungera som de här två musgenerna. Men i så fall har ingen hittat dem än.

Litteratur

Morgan HD, Sutherland HGE, Martin DIK, Whitelaw E. (1999) Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. Nature Genetics 23, ss. 314-318.

Rakyan VK, Chong S, Champ ME, Cuthbert PC, Morgan HD, Luu KVK, Whitelaw E. (2003) Transgenerational inheritance of epigenetic states at the murine AxinFu allele occurs after maternal and paternal transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, ss. 2538-2543.

Preludium till epigenetiken

På sista tiden har det skrivits en och annan mer eller mindre bra förklaring av epigenetik. Jag ska försöka göra en till. Epigenetik är nämligen för tillfället på modet och det dräller av epigenetiska resultat.

Det bästa sättet att se var det kan finnas utrymme epigenetiska fenomen kan vara att jämföra cellertyperna i kroppen hos flercelliga organismer som vi själva. Med några lysande undantag — vissa gener i immunförsvaret går igenom slumpvisa omflyttningar under immunförsvarets utveckling; könscellerna har bara en kopia av genomet; och då och då inträffar det ju mutationer — har alla cellerna samma DNA. Ändå är de såklart väldigt olika.

Framför allt tillverkar de olika proteiner. Proteinerna är cellernas verktyg för att få något att hända; och proteinerna kodas av gener. Att en gen uttrycks innebär att den skrivs av från DNA till RNA och sedan (oftast; om inte cellen av någon anledning gör sig av med RNA-kopian innan den hinner användas) att proteinet kommer tillverkas.

Det är en komplicerad blandning av olika faktorer som får en cell att uttrycka en viss kombination av gener. (Hur individen utvecklas under sin livstid är en hel vetenskap i sig som kallas utvecklingsbiologi — observera skillnaden mot evolutionsbiologi, som handlar om hur populationer förändras över generationerna.) Olika kemiska signaler som utsöndras i embryot styr den i rätt riktning, och kontakten med närliggande celler spelar också roll.

Allt börjar med det befruktade ägget (zygoten) som delar sig till alla celler i organismen (och i däggdjurens fall en del celler utanför själva organismen — de bildar placentan). Efter all uppmärksamhet stamceller har fått tror jag det här är bekant för de flesta: De första generationerna av celler är förmögna att bilda vilken celltyp som helst, de är så kallat pluripotenta. Efter ett antal delningar tappar cellerna den förmågan. Nästan oavsett vilken miljö de sätts i så finns det någonting inom dem som bestämmer vad de ska göra och inte göra — från insidan.

Här kommer epigenetiken in. Ett epigenetiskt fenomen är någon sorts minne som finns i cellen och som överförs till dottercellerna vid celldelning. De epigenetiska mekanismerna är alltså en delmängd av systemen som reglerar genuttryck.

Alltså, den vanligaste definitionen är nog att epigenetik är något i stil med studiet av ärftliga skillnader i genuttryck som inte kan förklaras av skillnader i DNA-sekvens. Den är inte helt problemfri, för det är inte riktigt klart till vilken grad alla fenomen som brukar kallas epigenetik faktiskt går i arv till dottercellen.

Det typiska epigenetiska fenomenet är DNA-metylering. Låt oss för tillfället hålla oss till djur. (Växter använder DNA-metylering på ett snarlikt sätt. Bakterier gör något helt annat.) DNA består av baserna som förkortas A, T, G och C. C:et, cytosin, finns i två varianter: cytosin och 5-metyl-cytosin. 5-metylcytosin har, som namnet antyder, en extra metylgrupp. Om vi så vill, så kan det betraktas som en femte bas.

På ställen där ett C följs av ett G, en så kallad CpG-dinukleotid (p:et står bara för bindningen mellan baserna) tenderar C:et att vara 5-metylcytosin. Åtminstone i större delen av genomet. Just i närheten av gener finns det ibland stora samlingar ometylerade CpG-dinukleotider som kallas CpG-öar. Metylering av CpG-dinukleotider i  framför allt CpG-öar nära gener, men också olika reglerande DNA-sekvenser, har kopplats till reglering av uttryck. Metylering betyder oftast att genen stängs av — till exempel är den avstängda kopian av en präglad gen ofta metylerad på någon kritisk sekvens. Men sambandet är inte alls helt utrett.

Hur som helst är DNA-metylering en av många mekanismer som reglerar vilka gener en cell uttrycker. Och epigenetik är alltså till hjälp att förstå hur celler differentieras och hur organismen utvecklas. Men det finns mer; häng kvar.