Att ta fram DNA och RNA (Så går det till, del 5)

Hittils har den här serien handlat om olika saker vi kan göra med nukleinsyror i labbet, och allihop har förutsatt att vi har en hyfsat ren lösning DNA eller RNA. Hur får vi en sådan?

Det finns massor av olika recept för att isolera DNA och RNA. Demonstrationen ovan är nog den enklaste tänkbara, men den ger knappast särskilt rent DNA. Jag tänkte att vi kunde titta på de två kanske viktigaste principerna. Varje tillverkare med självaktning har en egen variant som heter något snarlikt.

Alla metoder går i stora drag ut på att bryta sönder provet och på något sätt rena fram DNA och RNA från proteiner, fetter, kolhydrater och så vidare som finns i provet. I videon ovan är de två stegen 1) mosa jordgubbarna i en påse med diskmedel och 2) fälla DNA med alkohol och salt.

Det som varierar mest mellan olika prover är det första steget: på något sätt måste vi ta sönder provet för att cellerna ska öppnas och nukleinsyran komma ut. Hur mycket våld som krävs beror på vilken sorts prov det är frågan om — bakterieceller som växer i en näringslösning brukar är lättare att ta sönder en stammen från en växt eller kanske en bit ben.

Allt bygger på att nukleinsyrorna har andra kemiska egenskaper än proteiner och fetter. Båda metoderna fungerar för DNA eller RNA med lite olika justeringar. Men helt går det inte alltid att skilja DNA från RNA och för att vara på den säkra sidan finns det specifika DNA- eller RNA-nedbrytande enzymer som går att använda.

DNA och RNA är rätt lika molekyler, men DNA tål betydligt mer. Problemet med RNA är dels att det bryts sönder om vattenlösningen det ligger i värms upp. Dessutom är omgivningen full av RNAser, RNA-nedbrytande enzymer. De finns överallt (alla celler behöver kunna bryta ner RNA) och de är inte lätta att inaktivera. Därför är damm, fingrar och värme de främsta hoten mot våra dyrbara RNA-prover. Därför kan vi som jobbar med RNA ibland vara lite stirriga.

Fenol-kloroformextraktion

Extraktion är en gammal hederlig kemisk teknik. Det bygger på att polära och opolära vätskor — som olja och vatten — inte löser sig i varandra utan bildar två lager. I korthet går fenol-kloroformextraktionen till såhär: vi tar vårt sönderslagna prov som innehåller lite allt möjligt jox — proteiner, fett, kolhydrater, salter och så vidare — och blandar den med fenol och guanidintiocyanat. Guanidintiocyanat är ett salt som inaktiverar de flesta protiner och skyddar därför RNA från att bli nedbrutet av RNaser. Så häller vi på ett organiskt lösningsmedel som kloroform (vilket får en att känna sig som en gammal filmskurk).

Nu börjar själva extraktionen! Vi skakar som sjutton och väntar på att faserna ska separera igen. Det är som olja och vatten, men här är den organiska fasen tyngre än vattnet och lägger sig alltså under vattenfasen. Snart bildas två lager: det undre (som i vissa tillverkares version är rosafärgat — hurra!) är den organiska fasen och innehåller DNA och proteiner; det övre genomskinliga är en vattenlösning och där finns RNA. Det är bara att suga upp den övre fasen med en pipett och gå vidare med den.

Sedan fäller vi fram det från vattenlösningen. Det är samma sak som i videon ovan, men resultatet blir mycket renare, eftersom vi gjort en  extraktion först. Med hjälp av en alkohol och lite salt får vi nukleinsyran att falla ut och bilda en vit pellet i botten. Nukleinsyran är inte särskilt löslig i alkohol, så vi kan tvätta pelleten med etanol en eller ett par gånger. När den är tillräckligt ren suger vi bort etanolen, låter pelleten torka och löser upp den i vatten. Voilá — en hyfsat ren RNA-lösning!

Fenol-kloroform är en klassisk metod; den kan också användas till DNA-isolering och till att rena DNA efter olika enzymbehandlingar — men det tar tid och kemikalierna är duktigt giftiga.

Spinnkolonnmetoder

En kolonn är, i allmänhet, ett rör proppat med något material som används för att göra någon sort kemisk separation. En spinnkolonn är en liten kolonn som passar i en centrifug så att det går att snurra den och få vätska att passera genom den snabbare. Spinnkolonner för DNA- och RNA-isolering innehåller kisel, där nukleinsyran fastnar.

I korthet går det till såhär: vi blandar vårt prov med en lösning med ett guanidinsalt (åter igen) och häller i kolonnens ena ände. Nukleinsyran fastnar i kolonnen, men det andra går rakt igenom. Vi sköljer igenom kolonnen några gånger med etanolbaserad tvättlösning för att få bort så mycket skräp som möjligt. Sedan, när vi vill att nukleinsyran ska släppa, sätter vi till en vattenlösning eller i vissa kolonner bara rent vatten. Det som kommer ut fångar vi upp i ett rör. Klart!

Den här beskrivningen är mycket kortare än den ovanstående, och i allmänhet går det nog också fortare än fenol-kloroformmetoden. Vad som funkar bäst? Det beror förmodligen på provet och vad vi vill få ut av det. Väldigt korta RNA-strängar fastnar inte så bra i en spinnkolonn. Vissa prover kan bli renare i den ena metoden eller den andra — ibland krävs både och: först fenol-kloroform och sedan en spinnkolonn. Ibland kan det duga med någon enklare isoleringsmetod som mer liknar det som händer med  jordgubbarna i videon.

Med det tror jag vi behandlat allt som krävs för PCR-baserad DNA- och RNA-analys. Så, kära läsare, vad ska vi ta upp härnäst?

One thought on “Att ta fram DNA och RNA (Så går det till, del 5)

  1. Pingback: Inför NBIC45: hurra för pcr! | There is grandeur in this view of life

Kommentera

Fyll i dina uppgifter nedan eller klicka på en ikon för att logga in:

WordPress.com Logo

Du kommenterar med ditt WordPress.com-konto. Logga ut / Ändra )

Twitter-bild

Du kommenterar med ditt Twitter-konto. Logga ut / Ändra )

Facebook-foto

Du kommenterar med ditt Facebook-konto. Logga ut / Ändra )

Google+ photo

Du kommenterar med ditt Google+-konto. Logga ut / Ändra )

Ansluter till %s